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Aug 07, 2023

Échafaudages électriquement conducteurs imitant la structure hiérarchique des myofibres cardiaques

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2863 (2023) Citer cet article

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Des échafaudages électriquement conducteurs, imitant l'alignement directionnel unique des fibres musculaires dans le myocarde, sont fabriqués à l'aide de la technique de micro-stéréolithographie par impression 3D. Le diacrylate de polyéthylène glycol (polymère photosensible), l'Irgacure 819 (photo-initiateur), la curcumine (colorant) et la polyaniline (polymère conducteur) sont mélangés pour fabriquer l'encre conductrice qui est réticulée à l'aide d'une réaction de photopolymérisation radicalaire. La curcumine agit comme un filtre liquide et empêche la lumière de pénétrer profondément dans la solution photosensible et joue un rôle central dans le processus d'impression 3D. Les échafaudages obtenus présentent une morphologie bien définie avec une taille moyenne des pores de 300 ± 15 μm et des propriétés semi-conductrices avec une conductivité de ~ 10–6 S/m. Les analyses de voltamétrie cyclique détectent l'électroactivité et mettent en évidence comment le transfert d'électrons implique également une diffusion ionique entre le polymère et la solution d'électrolyte. Les échafaudages atteignent leur gonflement maximal 30 min après immersion dans le PBS à 37 ° C et après 4 semaines, ils démontrent un taux de dégradation hydrolytique lent typique du réseau de polyéthylène glycol. Les échafaudages conducteurs affichent une conductivité réglable et fournissent un environnement optimal aux cellules progénitrices cardiaques de souris en culture.

Les tissus biologiques sont généralement classés en fonction des types de cellules incorporées dans leur texture, de l'expression de différentes molécules contribuant à leur machinerie et des familles de facteurs sécrétés aux différentes étapes de leur différenciation. Cependant, ils sont également parcourus par de faibles courants électriques cruciaux pour leur communication et leur fonctionnement intercellulaires1. Dans le myocarde et les nerfs, ces courants basaux sont superposés par des ondes électriques cycliques autogénérées capables de générer des signaux et des forces mécaniques qui, à travers les cellules adjacentes, se déplacent vers les régions les plus périphériques du corps. Dans ce contexte, la fonction du tissu myocardique est modulée par les propriétés mécaniques uniques et la structure anisotrope du tissu cardiaque dans lequel le large réseau tridimensionnel de matrice extracellulaire (ECM) oriente les cardiomyocytes, les couple mécaniquement assurant leur connectivité électrique, et fournit un soutien élastique lors de la contraction ventriculaire. L'orientation des fibres myocardiques varie de manière transmurale dans toute la paroi ventriculaire. Ces fibres s'étendent dans le sens de l'hélice droite dans la région sous-endocardique, passent circonférentiellement à travers la paroi médiane et tournent dans le sens de l'hélice gauche dans la région sous-épicardique contribuant de manière significative au pompage cardiaque2,3. Les événements traumatiques et les maladies dégénératives, entre autres, entraînent souvent des dommages irréparables à cette admirable bioarchitecture en raison de la faible capacité de régénération innée du cœur4. Les zones lésées sont remplacées par du tissu cicatriciel riche en collagène qui déforme la géométrie ventriculaire et obstrue le flux régulier de signaux électriques entraînant des arythmies et une insuffisance cardiaque à long terme5.

Au cours des dernières décennies, les progrès des sciences biologiques, de l'ingénierie, de la science des matériaux et des techniques de fabrication micro/nano avancées ont suggéré la possibilité de réparer les régions ventriculaires blessées en fabriquant et en implantant des bandes de myocarde sain. À cette fin, une approche multidisciplinaire (ingénierie tissulaire) a été employée pour faire correspondre la complexité de la bioarchitecture et de la fonction des tissus myocardiques. Dans une expérience d'ingénierie tissulaire typique, les cellules souches sont ensemencées dans un échafaudage polymère biocompatible imitant vaguement l'ECM du tissu. L'échafaudage est généralement composé de biomatériau naturel ou synthétique ou d'une combinaison des deux (échafaudage) et en utilisant cette approche, plusieurs tissus artificiels semblables à des cœurs ont été conçus et implantés in vivo6,7,8,9,10,11. Cependant, malgré des efforts extraordinaires dans le monde entier, les résultats ne sont pas encore suffisants pour envisager une utilisation clinique12,13. La cause de cet échec, entre autres, se trouve principalement dans des échafaudages imitant mal la bioarchitecture tissulaire14. Initialement, les échafaudages étaient simplement destinés à servir de support mécanique pour que les cellules cultivées se développent et prolifèrent. Plus tard, il a été révélé que la différenciation cellulaire peut être améliorée via des propriétés physiques, chimiques, mécaniques et biologiques spécifiques de l'échafaudage en attendant que les cellules sécrètent leur propre ECM.

Une littérature abondante pourrait être trouvée sur les échafaudages démontrant quelques-unes ou toutes ces propriétés15,16,17,18. Cependant, deux problèmes majeurs n'ont pas été traités de manière adéquate dans les échafaudages autrement non conducteurs d'électricité actuellement utilisés. Le premier est de savoir comment conférer à l'échafaudage la capacité d'induire la bonne orientation des cardiomyocytes. La seconde est de savoir comment la création d'un environnement électroconducteur peut améliorer la communication intercellulaire et la synchronisation entre les cellules souches cardiaques immatures souffrant d'une conductivité réduite en raison d'une organisation encore médiocre des jonctions lacunaires.

Les jonctions lacunaires sont des structures de la membrane cellulaire qui permettent l'échange rapide d'ions, nécessaire à la propagation efficace des potentiels d'action à travers la paroi cardiaque et à la propagation des molécules de signalisation. Cependant, les jonctions lacunaires des cardiomyocytes humains sont réparties sur toute leur surface cellulaire au cours des stades néonataux et n'atteignent leur maturation finale et leur polarisation dans les disques intercalés que lorsque l'être humain a 6 ans19. Une distribution similaire a été observée chez les souris et les chiens où les jonctions lacunaires n'ont atteint leur maturité et leur polarisation que lorsque les animaux étaient âgés de 90 jours20. Ces données suggèrent que l'électroconductivité myocardique est associée à deux réseaux électriques différents : le premier est actif au début de la vie, est basé sur l'ECM et contribue grandement à signaler les cellules immatures en développement. Alors que le second est généralement basé sur les cardiomyocytes matures, transmet le stimulus de contraction et a un effet médiocre sur le phénotype cellulaire lorsqu'il est établi.

À partir d'études antérieures sur des méthodes innovantes pour préparer des biomatériaux et des biosystèmes21,22,23, l'objectif principal de la présente étude était de développer des échafaudages électriquement conducteurs imitant l'orientation hiérarchique des myofibres cardiaques en utilisant une approche de micro-stéréolithographie par projection d'impression 3D d'un point de vue technique.

La conductivité a été obtenue en mélangeant le polymère conducteur polyaniline (PANI) avec des hydrogels de diacrylate de polyéthylène glycol (PEGDA) pour fabriquer une encre conductrice pour l'impression 3D. Les échafaudages obtenus ont démontré des propriétés semi-conductrices (~ 10–6 S/m) avec une taille moyenne de pores de 300 ± 15 μm. La conductivité peut être adaptée facilement en contrôlant la concentration de PANI dans la solution de précurseur. La viabilité des cellules progénitrices cardiaques de souris cultivées sur des échafaudages conducteurs était comparable à celle des cellules cultivées sur des échafaudages non conducteurs.

Tous les réactifs ont été achetés auprès de Merck KGaA sauf mention contraire et ont été utilisés tels que reçus.

PANI a été synthétisé selon un protocole préalablement optimisé24. En bref, après distillation sous pression réduite, 5 mmoles d'aniline (Fluka) ont été ajoutées à une solution de HCl 1 M contenant une quantité appropriée de dodécylsulfate de sodium (SDS) et soniquées pendant 30 min. En parallèle, 5 mmoles de persulfate d'ammonium ont été ajoutées à une autre solution d'HCl 1M. Ce mélange a été lentement ajouté au mélange d'aniline ci-dessus, refroidi à 0-5 ° C et laissé sous agitation pendant 6 h. Pendant ce temps, un précipité de PANI vert foncé a commencé à se former indiquant la polymérisation de l'aniline en PANI. Après précipitation complète, le PANI a été filtré et lavé abondamment avec une solution de HCl 1 M puis avec de l'eau et de l'éthanol. Après un lavage soigneux, la bouillie a été séchée pendant une nuit à 50°C sous vide. La poudre de PANI obtenue a ensuite été broyée dans un mortier et un pilon pour obtenir une granulométrie fine.

La solution précurseur pour la photopolymérisation était un mélange de PEGDA (PM 575 Da) comme polymère photosensible, de curcumine extraite de Curcuma longa comme colorant absorbant la lumière et de bis(2,4,6-triméthylbenzoyl)-phénylphosphineoxyde (également dénommé Irgacure 819) comme photo-initiateur. La curcumine et l'Irgacure ont été dissous dans la solution de rapport volumique PEGDA: éthanol 3: 1 pour obtenir le système précurseur (tableau 1). Le ballon recouvert d'une feuille d'aluminium a été laissé une nuit sous agitation dans un environnement sombre. Plus tard, une quantité appropriée de la poudre de PANI synthétisée a ensuite été dispersée dans la solution de précurseur par sonication et agitation magnétique. Ce processus a été répété à chaque fois pour obtenir des encres photodurcissables avec différentes quantités de PANI dispersées.

La micro-stéréolithographie par projection (PµSL) a été utilisée pour fabriquer les échafaudages, comme illustré à la Fig. 1. L'ensemble de la configuration PμSL a été monté sur une planche à pain optique. Pour fabriquer un échafaudage, il a d'abord été conçu à l'aide du logiciel AutoCAD version 2016 pour Windows (https://www.autodesk.com/products/autocad) après avoir pris en compte les paramètres de conception optimaux tels que la forme, la taille des pores, la géométrie, les dimensions, etc. Un fichier de stéréolithographie (.stl) a été exporté et utilisé pour découper virtuellement la géométrie 3D en projections 2D à l'aide du logiciel Slic3r version 1.3.0 pour Windows (https://slic3r.org/). Ces projections en tranches ont été utilisées comme impressions numériques et elles peuvent également être créées dans le logiciel PowerPoint. Un rétroprojecteur (Acer X1385WH) contenant une lampe à arc au mercure à haute pression avec un flux lumineux de 3400 lumens a été utilisé comme source de lumière visible.

Schéma de la configuration de micro-stéréolithographie d'impression 3D sur mesure. L'échafaudage est conçu à l'aide d'AutoCAD et la géométrie 3D est virtuellement découpée en projections/impressions 2D qui agissent comme un photomasque numérique. Le projecteur fait briller ces impressions sur un miroir qui sont ensuite réfléchies sur la surface de la solution photosensible. Seule la zone éclairée de la solution est réticulée via la réaction de photo-polymérisation imprimant une couche solide. La platine est descendue de quelques microns et la solution fraîche recouvre cette couche imprimée. Encore une fois, la solution est allumée avec une autre impression pour déposer une deuxième couche au-dessus de la première couche. De cette manière, un échafaudage 3D est fabriqué en déposant des couches 2D les unes sur les autres. Certaines images ont été obtenues auprès de Servier Medical Art sous la licence CC-BY 3.0.

Le mouvement 3 axes de la platine était contrôlé manuellement via les micromètres montés dessus et ils pouvaient déplacer la platine d'une distance minimale de 10 μm le long de chaque axe. Avant de commencer le processus d'impression, la platine a été immergée de 100 µm dans la solution correspondant à l'épaisseur de chaque couche imprimée. Puis à partir du projecteur, chaque impression a été focalisée sur un miroir via une lentille convexe (longueur focale = 201,0 mm). Elle se réfléchissait alors sur la surface de la solution photosensible dans laquelle la platine était déjà plongée. La zone de la solution photosensible éclairée par une empreinte a réticulé la solution via la réaction de polymérisation radicalaire, produisant ainsi une couche 2D. L'épaisseur de cette couche imprimée était de 100 µm correspondant à la profondeur d'immersion initiale de la platine dans la solution. Après le dépôt de la première couche, la platine a été à nouveau immergée dans la solution de 100 µm et la solution fraîche a recouvert cette couche imprimée. Elle a ensuite été éclairée avec la deuxième empreinte déposant ainsi la deuxième couche de 100 µm d'épaisseur au-dessus de la première couche. Le dépôt continu de couches les unes sur les autres a produit un échafaudage 3D avec une épaisseur contrôlée de chaque couche. La matrice PEGDA a été réalisée lorsque la solution a été éclairée avec une empreinte solide (par exemple un cercle complet) contrairement aux empreintes fibreuses. Cela a produit à son tour une couche solide sans pores, via la même réaction de polymérisation radicalaire décrite sur la figure 1.

Les spectres d'absorption de la lumière ont été obtenus dans la plage de 300 à 800 nm à l'aide d'un spectrophotomètre (Perkin Elmer Lambda 750). La microscopie électronique à balayage (SEM) a été réalisée pour analyser la morphologie des échafaudages. La surface des échafaudages a été scannée à différentes tensions (5, 10, 15 kV) et grossissements à l'aide du microscope électronique à balayage HITACHI TM 4000. La spectroscopie infrarouge a été réalisée à l'aide du spectromètre FTIR ThermoFisher Scientific™ Nicolet™ iS50 avec module intégré ATR à cristal de diamant. Le balayage a été réalisé entre 4000 et 500 cm-1 en mode absorbance.

La conductivité apparente des échafaudages a été évaluée via deux mesures de conductivité de sonde à température ambiante à l'aide du multimètre Keithley 2700. Des échafaudages (quelques microns d'épaisseur) ont été placés entre deux sondes en acier (rayon de 1,5 mm) pour mesurer leur résistance électrique en mode balayage temporel. La résistance scannée à différents moments a été enregistrée à l'aide du logiciel LabVIEW. La conductivité électrique a été calculée à l'aide de l'équation. (1):

où σ = conductivité électrique (S/m), l = épaisseur de l'échafaudage (m), r = rayon de la sonde en acier (m), R = résistance électrique moyenne (Ω).

La réponse électrochimique a été évaluée à l'aide de la voltamétrie cyclique (CV) dans une cellule standard à trois électrodes à un compartiment à l'aide d'un poste de travail électrochimique compact Palm Sense. Les courbes CV ont été obtenues dans la plage de + 0,4 V à + 0,9 V à différentes vitesses de balayage (10–18 mV/s). Une électrode au calomel saturé (SCE) et une feuille de platine ont été utilisées respectivement comme électrode de référence et contre-électrode. L'électrode de travail a été réalisée en fournissant un contact en platine à l'arrière des échafaudages d'investigation.

Le degré de gonflement a été mesuré pour évaluer la limite de gonflement des échafaudages dans des conditions physiologiques (pH = 7,4, 37 ° C). Les échafaudages ont été immergés dans du PBS 1X et ont été maintenus à 37 ° C. Le degré de gonflement a été déterminé en mesurant la différence de masse entre l'échafaudage sec et l'échafaudage humide à différents intervalles de temps en utilisant l'équation suivante. (2):

où Mw = Masse de l'échafaudage humide au temps t, Md = Masse de l'échafaudage sec.

La cinétique de dégradation a été surveillée pour connaître le taux de dégradation des différents échafaudages. À cette fin, les échafaudages ont été immergés dans le PBS 1X à 37 ° C pendant 4 semaines. Après chaque semaine, la masse perdue par chaque échafaudage a été calculée en mesurant la différence entre la masse de l'échafaudage entièrement gonflé et la masse de l'échafaudage après chaque semaine en utilisant l'équation suivante. (3):

où Ms = masse de l'échafaudage entièrement gonflé, Mt = masse de l'échafaudage au temps t.

Des cellules progénitrices cardiaques de souris (mCPC) ont été utilisées pour tester la biocompatibilité de l'échafaudage. Les cellules ont été isolées du cœur de souris C57/BI âgées de 6 semaines comme décrit précédemment25. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM (Gibco) contenant 10 % de FBS (Gibco), 1 % de pénicilline-streptomycine et 1 % de L-Glutamine (Sigma Aldrich). Avant l'ensemencement des cellules, les échafaudages ont été trempés dans une solution d'éthanol à 70 % pendant 1 h pour la stérilisation. Après cela, ils ont été séchés dans une hotte biologique ventilée stérile et placés dans une plaque de 24 puits. Les échafaudages ont ensuite été lavés avec du PBS stérile et équilibrés avec du DMEM contenant 20 % de FBS pendant 24 h à 37 °C pour améliorer l'adhésion cellulaire.

Les cellules ont été ensemencées à la densité de 2 × 104 cellules/cm2 et incubées dans du DMEM contenant 10 % de FBS à 37 °C. Les cellules placées dans des puits sans échafaudages ont été considérées comme le groupe témoin. Après 120 h, les cellules adhérentes et en suspension de chaque puits ont été récoltées et colorées avec un dosage de bleu trypan à 0,4 % pour évaluer la viabilité (Sigma-Aldrich, Milan, Italie). Les cellules vivantes et mortes ont été comptées au microscope optique inversé réalisé en triplicat et répété trois fois.

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, https://www.graphpad.com). Les données de six expériences indépendantes ont été quantifiées et analysées pour chaque variable. Le test t bilatéral avec variance égale a été utilisé pour comparer les moyennes ainsi que le test ANOVA unidirectionnel. Le seuil de signification statistique a été fixé à P < 0,05 et les écarts-types (ET) des valeurs moyennes ont été calculés pour chaque type d'échantillon. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD

L'efficacité de la réaction de photopolymérisation dépend fortement de l'équilibre de la capacité d'absorption de la lumière des composants individuels dans la solution précurseur. Cette capacité peut être décrite en termes de coefficient d'absorption (α) qui indique la quantité de lumière absorbée par centimètre de la solution en la traversant. Pour le calculer, tout d'abord, les spectres d'absorbance en fonction de la longueur d'onde des composants ont été obtenus à des concentrations plus faibles à l'aide d'un spectrophotomètre, comme indiqué sur les figures 2a à c. La mesure directe de ces spectres par rapport à la concentration réelle dans la solution n'a pas pu être obtenue car la spectroscopie UV-Visible ne fonctionne pas bien avec des solutions concentrées.

Les spectres d'absorbance de (a) la curcumine dans l'éthanol, (b) l'Irgacure dans l'acétone et (c) le PANI dans le PEGDA à de faibles concentrations. Les encarts montrent les valeurs d'absorbance à 400 nm tracées par rapport à ces concentrations de chaque composant pour obtenir un graphique linéaire. Ces graphiques linéaires extrapolés ont ensuite été utilisés pour estimer les valeurs d'absorbance utilisées dans la synthèse réelle. ( d ) Le coefficient d'absorption dans la plage de longueurs d'onde de 300 à 800 nm de tous les composants par rapport à leur concentration réelle dans la solution finale.

Après avoir obtenu plusieurs spectres d'absorbance en fonction de la longueur d'onde à de faibles concentrations, les valeurs d'absorbance au seuil de 400 nm ont été tracées par rapport aux concentrations correspondantes pour obtenir les graphiques linéaires d'absorbance en fonction de la concentration pour tous les composants. Ce graphique linéaire peut également être obtenu à n'importe quelle longueur d'onde puisque la proportion d'absorption restera la même.

Les graphiques linéaires ont été extrapolés pour estimer les valeurs d'absorbance par rapport aux concentrations réelles dans la solution et ces valeurs ont été remplacées dans l'Eq. (4) pour calculer le coefficient d'absorption pour tous les composants à une longueur d'onde de 400 nm :

où A = valeurs d'absorbance du graphique linéaire, d = longueur du trajet = 0,1 cm (épaisseur de la cuvette).

Les coefficients d'absorption ont été calculés dans la plage de longueurs d'onde de 300 à 800 nm et tracés à la Fig. 2d, montrant le pouvoir d'absorption relatif de la curcumine, de l'Irgacure et du PANI dans la solution précurseur. Ce sentiment de compétition entre les composants individuels pour absorber la lumière nous a permis de trouver leur concentration optimale dans la solution finale. Par exemple, (i) la concentration d'Irgacure doit être suffisamment élevée pour générer des radicaux libres pour réticuler la solution, (ii) la curcumine doit avoir une concentration suffisante pour éviter que la lumière ne pénètre profondément dans la solution mais en même temps doit être la moins possible pour permettre la génération de radicaux libres sans absorber une grande partie de l'énergie lumineuse, (iii) le PANI ne devrait pas non plus absorber la majeure partie de la lumière entrante mais devrait être suffisant pour conférer une conductivité électrique à la matrice PEGDA hautement inerte. Dans notre configuration de micro-stéréolithographie par projection sur mesure, la réaction de photopolymérisation a eu lieu dans la plage de 400 à 450 nm appelée «région visible pour la réaction de photopolymérisation». Au-delà de cette plage, Irgacure n'absorbe aucune lumière pour produire des radicaux libres pour la réticulation, comme illustré à la Fig. 2 (en bas à droite). Généralement, la curcumine absorbe fortement la lumière par rapport à Irgacure à la même concentration. Par conséquent, dans la solution finale, sa concentration a été maintenue beaucoup plus faible (0,016 %) par rapport à la concentration d'Irgacure (1,83 %).

L'orientation des myofibres change selon différents angles à travers l'épaisseur du myocarde (Fig. 3a). Les myofibres tournent de + 70° à + 50° dans la région sous-épicardique, à 0° dans la paroi médiane et de − 50° à − 70° dans la région sous-endocardique26. Pour imiter cette bio-architecture polyvalente, les brins de chaque couche imprimée ont été alignés le long de ces angles, comme illustré à la Fig. 3b. Le dépôt de ces couches 2D les unes sur les autres a créé un échafaudage 3D. La figure 3c–f montre les images optiques des échafaudages imprimés en 3D. Dans cette étude, la distance entre deux brins est exprimée en "taille de pore" selon la classification de la taille des pores conforme au système international de préfixes27. Les échafaudages PEGDA non conducteurs avaient un diamètre moyen de brin de 345 ± 6 µm, avec une taille de pores d'environ 292 ± 13 µm, mesurée à l'aide du logiciel ImageJ. Alors que les échafaudages conducteurs avaient un diamètre moyen de brin de 370 ± 10 µm avec une taille moyenne de pores de 300 ± 15 µm. La distribution homogène de la phase PANI à l'intérieur des échafaudages leur a donné la couleur sombre caractéristique (Fig. 3g) et a conféré des propriétés semi-conductrices à la matrice PEGDA hautement inerte. Le courant électrique peut circuler à travers les chaînes PANI via le mécanisme de saut d'électrons, c'est-à-dire que lorsqu'ils sont stimulés électriquement, les électrons libres peuvent sauter d'un polaron/bipolaron (natif au PANI dopé) à un autre. Les détails du mécanisme de conductivité sont donnés ailleurs28.

Structure et morphologie des échafaudages imprimés. (a) Dans le myocarde, les myofibres sont orientées à différents angles de manière hiérarchique. (b) Différentes couches alignées le long de ces angles ont été empilées les unes sur les autres pour obtenir un échafaudage 3D imitant cette structure. (c) échafaudage PEGDA non conducteur à 5X et (d) à 10X, (e) échafaudage conducteur (0,3 % PANI) à 5X et (f) à 10X. ( g ) Échafaudages avec différentes concentrations de PANI. La figure 3A a été réalisée à l'aide de Servier Medical Art sous la licence CC-BY 3.0.

La curcumine a été utilisée comme filtre liquide dans ce processus d'impression 3D. Il empêchait la lumière de pénétrer profondément dans la solution pour atteindre les couches imprimées inférieures et s'assurait que seul le haut de la solution recevait suffisamment d'énergie lumineuse pour que la réaction de photopolymérisation ait lieu. En l'absence de curcumine, la lumière a pénétré profondément dans la solution produisant des échafaudages avec des pores fermés et une morphologie médiocre, comme le montre la Fig. 4.

Rôle de la curcumine dans notre configuration d'impression 3D sur mesure. L'échafaudage a démontré une morphologie bien définie et des pores ouverts avec de la curcumine dans la solution précurseur (à gauche, 5X). En l'absence de curcumine, les couches se sont diffusées les unes dans les autres, entraînant une mauvaise morphologie de l'échafaudage et des pores fermés (à droite, 5X). La couleur jaune caractéristique peut être distinguée entre les échafaudages en raison de la curcumine qu'elle contient (en haut à gauche).

Une microscopie électronique à balayage a été réalisée pour évaluer la morphologie des échafaudages imprimés. Comme on peut le voir sur les figures 5a à c en l'absence de PANI dans la solution de précurseur, les échafaudages non conducteurs obtenus avaient une géométrie et une taille de pores bien définies en raison de la transparence optique de la solution. Inversement, la solution contenant PANI a rendu l'impression plus complexe puisque PANI commence également à absorber la lumière entrante, comme illustré à la Fig. 2 (en bas à droite). Cela a rendu la réaction de photopolymérisation inefficace dans une certaine mesure en fonction de la concentration de PANI et les échafaudages résultants avaient une géométrie quelque peu rugueuse avec une taille de pore irrégulière, comme le montre la Fig. 5d – f. Pour résoudre ce problème, la solution a été exposée pendant des durées plus longues par impression, comme indiqué dans le tableau 1. Au-delà de la concentration de PANI de 2,0 %, l'impression d'un échafaudage avec des caractéristiques géométriques bien définies était assez difficile. Cela peut être associé au fait que le coefficient d'absorption (α) du PANI à ces concentrations était suffisamment élevé pour prévaloir sur la capacité d'absorption de la lumière des autres composants qui rendait la réticulation de la solution difficile. De ce fait, aucun radical libre n'a été produit à cette concentration pour réticuler la solution. De plus, à des concentrations de PANI de 2,5 % et 3,0 %, la solution est devenue trop visqueuse pour être travaillée. Même après une exposition de plus de 20 s par impression, un échafaudage bien défini avec une morphologie et une taille de pores appropriées n'a jamais été atteint. Seul un disque solide a été obtenu à ces concentrations, qui a ensuite été caractérisé à l'aide de la microscopie électronique, comme illustré à la Fig. 5g – h et d'autres techniques.

Morphologie des échafaudages imprimés. (a) matrice de PEGDA sans PANI, (b) échafaudage PEGDA non conducteur à 60X et (c) à 150X, (d) 2 % de PANI intégré dans la matrice PEGDA, (e) échafaudage conducteur avec 2 % de PANI à 50X et (f) à 100X, (g) la morphologie ridée indique la distribution homogène de 3 % de PANI dans la matrice PEGDA à 100X, et (h) à un grossissement de 200X.

La morphologie hiérarchique de l'échafaudage a également été évaluée à l'aide d'une analyse SEM plus approfondie. La figure 6a – c correspond aux échafaudages PEGDA sans PANI, tandis que sur la figure 6d – f, l'échafaudage PEGDA-PANI a 2,0% de PANI. On peut voir que les brins tournent à différents angles indiqués par le cercle sur la figure 6a. Une image plus agrandie (Fig. 6b) montre la rotation de divers brins profondément dans l'échafaudage indiqué par des nombres qui correspondent aux numéros de couche sur la Fig. 3b. La vue en coupe transversale des échafaudages peut être vue sur la Fig. 6c, f dans laquelle les brins se déplacent dans le plan du papier. On peut voir sur ces figures que les brins ont été déposés les uns sur les autres en s'alignant selon des angles différents confirmant la morphologie hiérarchique des échafaudages. La concentration maximale de PANI à laquelle l'impression était possible à l'aide de notre imprimante PμSL personnalisée était de 2,0 %. C'est pourquoi de nombreuses particules PANI peuvent être vues sur la figure 6f, tout comme ces particules peuvent être vues intégrées dans la matrice PEGDA sur la figure 5d. Contrairement à cela, l'échafaudage sans PANI avait une morphologie bien définie, comme le montrent les figures 6c, 5b et 5c.

Morphologie hiérarchique des échafaudages imprimés. (a) échafaudage PEGDA à 44X tandis que le cercle indique la rotation des brins profondément dans l'échafaudage, et (b) échafaudage PEGDA à 133X tandis que les chiffres indiquent la couche 1 sur le dessus et les couches suivantes profondément dans l'échafaudage tournant à certains angles, (c) croix -section de l'échafaudage à 107X, (d) PEGDA avec 2,0 % de PANI à 44X, et (e) à 133X, (f) coupe transversale à 67X représentant différentes couches déposées les unes sur les autres lors de l'impression 3D.

PANI existe dans trois états redox : leucoémeraldine entièrement réduite, émeraldine partiellement oxydée et pernigraniline entièrement oxydée29. Ces structures peuvent être protonées ou déprotonées, que ce soit dans un environnement acide ou basique, respectivement. Sans protonation, ces formes sont qualifiées de « base » comme l'émeraldine base. Après protonation, ils sont appelés "sel" tel que le sel d'émeraude. Le sel d'émeraldine est la seule forme électroconductrice de PANI. La spectroscopie infrarouge a fourni des informations sur les états d'oxydation des chaînes PANI. L'analyse du spectre vibrationnel a mis en évidence la forme émeraude protonée de PANI obtenue au cours du processus de synthèse (Fig. 7).

Spectre FTIR-ATR de forme conductrice (sel d'émeraude) de PANI (bleu), PANI intégré dans PEGDA (rouge) et PEGDA (noir).

En particulier, dans les spectres des composites PANI et PEGDA-PANI (ligne bleue et rouge, respectivement), on peut observer les pics à 809 et 1569 cm−1, représentant le mode de vibration de flexion C–H de l'anneau benzénique et le C =C étirement de l'anneau quinoïde30,31. Alors que le pic à 1226 cm-1 dans le spectre PANI, décalé à 1190 cm-1 dans le PEGDA-PANI peut être attribué au mode d'étirement C–N dans le groupe benzénoïde32. Ces signaux distinctifs confirment la synthèse réussie du PANI sous la forme conductrice, c'est-à-dire le sel d'émeraude. Les pics caractéristiques de PEGDA peuvent être trouvés à 1095, 1723 et 2868 cm-1 dans les spectres PEGDA et PEGDA-PANI (ligne noire et rouge, respectivement). Ces signaux peuvent être respectivement attribués à la vibration d'étirement des –C–O–C–, –CH et –C=O du squelette PEGDA33.

La technique à deux sondes a été utilisée pour mesurer la conductivité électrique globale des échafaudages imprimés. Le tableau 2 rapporte les valeurs obtenues pour les échafaudages PEGDA-PANI par rapport à celles du tissu myocardique murin et de l'échafaudage PEGDA inerte. On peut noter que le PEGDA se caractérise par une conductivité de l'ordre de 10 à 9 S/m typique des isolants en plastique. Cependant, l'introduction de PANI dans cet échafaudage inerte a augmenté la conductivité de 103 fois jusqu'à ~ 10–6 S/m, conférant ainsi un comportement semi-conducteur. Cette valeur est comparable à celles obtenues pour les matériaux PEGDA-PANI avec le même taux de charge34. L'amélioration des propriétés conductrices suit l'augmentation de la concentration de PANI indiquant qu'un transfert de charge plus efficace entre les chaînes de PANI a été réalisé par la formation d'un réseau conducteur homogène à l'intérieur de la matrice PEGDA. Aucune réponse électrique n'a été détectée en dessous d'une teneur en PANI de 0,9 %. Cela pourrait être dû à un manque de réseaux conducteurs en vrac parmi les chaînes polymères.

Des mesures de voltamétrie cyclique (CV) ont été effectuées pour tester l'activité électrochimique des échafaudages produits. L'analyse a été effectuée dans une solution de HCl 0,1 M et les données ont été acquises à différentes vitesses de balayage. Il ressort de la figure 8 que les courbes CV montrent de larges pics anodiques (Ea) et cathodiques (Ec) à environ + 0,74 V et + 0,66 V, respectivement. Ce couple redox peut être lié au passage de la forme PANI émeraude semi-oxydée à la forme pernigraniline complètement oxydée et inversement36,37. La présence d'une telle caractéristique électrochimique indique la réversibilité chimique des processus redox. De plus, une augmentation de la densité de courant a été observée avec l'augmentation des concentrations de PANI dans la matrice PEGDA conformément à ce qui a été trouvé pour le comportement électrique. Il est intéressant de noter que les échafaudages avec 0,3 % et 0,6 % de PANI sont capables de répondre à la stimulation électrique tout en effectuant le CV, alors qu'il n'est pas possible de mesurer leurs valeurs de conductivité via la méthode à deux sondes. Ces résultats pourraient être clarifiés en considérant que les processus électrochimiques impliquent non seulement un transfert d'électrons mais également une diffusion ionique entre le polymère et la solution d'électrolyte.

Voltammogrammes cycliques d'échafaudages conducteurs à différents taux de balayage de (a) 0,3 % PANI, (b) 0,6 % PANI, (c) 0,9 % PANI et (d) 1,5 % PANI.

Comme on peut l'observer sur la figure 8, une augmentation de la densité de courant avec une vitesse de balayage allant de 10 à 80 mV/s a été constatée. Alors que les pics anodiques (EA) conservent leur position, les pics cathodiques (EC) sont légèrement décalés vers un potentiel inférieur. Cette caractéristique peut être associée à l'irréversibilité électrochimique partielle de la réduction de chaîne probablement due à une cinétique complexe du processus. Cela pourrait également être dû à certaines modifications chimiques/structurelles accompagnant le transfert d'électrons22. En bref, l'analyse des investigations électrochimiques a mis en évidence l'électroactivité et la capacité de l'inclusion de PANI à moduler la concentration ionique dans la matrice d'hydrogel PEGDA. De cette manière, cette fonctionnalité peut être exploitée efficacement dans plusieurs domaines biomédicaux pour produire des dispositifs/échafaudages imitant la nature électrique des systèmes biologiques.

Le degré de gonflement a été mesuré en immergeant les échafaudages dans le PBS 1X à 37 ° C pendant 24 h. Comme le montre la figure 9, le degré de gonflement maximal des échafaudages (≤ 60 %) est imprononcé par rapport aux hydrogels typiques qui présentent généralement des comportements de gonflement brusque. Les cellules cultivées exposées à des environnements en expansion abrupte peuvent souvent déclencher l'apoptose en raison des contraintes élevées générées dans le réseau d'hydrogel en expansion38. Dans notre cas, tous les échafaudages ont démontré un comportement de gonflement quelque peu stable et ont atteint leur limite dans les 30 minutes d'immersion dans le PBS. La présence de PANI à l'intérieur de la matrice PEGDA a diminué l'ampleur du gonflement quelle que soit sa concentration. Cela peut être dû à une rigidité plus élevée probable du matériau composite par rapport à un échafaudage en hydrogel PEGDA pur.

Degré de gonflement des échafaudages imprimés en 3D avec différentes concentrations de PANI.

La dégradation des échafaudages imprimés a été étudiée en immergeant les échafaudages dans du PBS 1X à 37 ° C pendant 4 semaines car il est bien connu que les liaisons ester (–O–C=O), généralement formées lors de la réticulation radicalaire des hydrogels PEGDA, sont sujets aux réactions d'hydrolyse39.

Comme nous pouvons le voir sur la figure 10, pour les faibles concentrations, il n'y a pas de corrélation significative entre le processus de dégradation et la présence de PANI dans la matrice PEGDA dans l'erreur expérimentale. Une dégradation plus constante est enregistrée à 2 % d'inclusion de PANI, atteignant une perte de masse de 15 % après quatre semaines. Cela peut être associé à une réticulation PEGDA plus faible raisonnablement induite par la présence plus élevée de PANI dans cet échantillon.

Profil de dégradation hydrolytique des échafaudages imprimés en 3D avec différentes concentrations de PANI.

La viabilité des cellules progénitrices cardiaques de souris (mCPC) a été évaluée par le test Trypan Blue après 5 jours d'incubation comme le montre la Fig. 11. Le groupe témoin pour cette expérience était la suspension cellulaire placée dans différents puits d'une plaque de 24 puits sans aucun échafaudage dans les puits. Les résultats ont démontré que les échafaudages n'induisaient pas d'effets cytotoxiques profonds entravant la croissance cellulaire par rapport au groupe témoin. En effet, tous les échafaudages ont démontré une bonne biocompatibilité et la viabilité n'était pas très différente par rapport au groupe témoin. Cependant, la nature électrique des échafaudages conducteurs semblait améliorer la viabilité par rapport aux échafaudages non conducteurs, bien que les résultats ne soient pas statistiquement significatifs car la viabilité moyenne de tous les groupes semble être la même (P = 0,23 entre les groupes, unidirectionnel ANOVA). Les échafaudages conducteurs peuvent avoir conduit à une meilleure communication intercellulaire améliorant ainsi la viabilité relative en raison de leur nature électrique, une caractéristique des échafaudages conducteurs observés dans des études antérieures40,41,42. Cela pourrait également être une raison de l'existence d'une signification statistique (via le test t) entre le contrôle et les échafaudages PANI à haute concentration, tandis que la faible concentration de PANI ou les échafaudages PEGDA purs n'ont pas entraîné de signification statistique en raison de l'absence de communication intercellulaire. Ces observations montrent que les échafaudages PEGDA-PANI pourraient être une meilleure alternative aux échafaudages non conducteurs traditionnels lorsqu'il s'agit de régénérer des tissus hautement conducteurs.

Viabilité des cellules progénitrices cardiaques de souris (mCPC) sur les échafaudages imprimés (n = 6). Sur la gauche, les micrographies représentatives montrent des mCPC colorés avec (A) DAPI (noyaux en bleu), (B) F actine (rouge) et (C) leur fusion. En haut à droite, la viabilité cellulaire a été évaluée via le test Trypan Blue après 5 jours de culture. Les barres représentent la viabilité des cellules par rapport au pourcentage du contrôle. Les données sont représentées en moyenne ± SD des expériences en triple. Un test t bilatéral avec une variance égale a été effectué pour déterminer la signification statistique (* P <0, 05) entre le groupe témoin (suspension cellulaire) et les autres groupes (suspension cellulaire + échafaudage) tandis qu'une ANOVA unidirectionnelle entre les groupes a donné des résultats statistiquement insignifiants. résultats (P = 0,23) montrant que la viabilité moyenne était la même parmi tous les groupes comme on peut l'observer par les valeurs indiquées dans le graphique à barres.

Le Saint Graal de l'ingénierie tissulaire a toujours été d'imiter exactement les caractéristiques du tissu destiné à l'ingénierie. Ces caractéristiques comprennent, mais sans s'y limiter, la bioarchitecture tissulaire, l'élasticité/rigidité, la biodégradabilité et la biocompatibilité. Un rôle majeur dans cette entreprise est joué par l'échafaudage, une structure polymère conçue pour soutenir la croissance et la différenciation cellulaire, tout en imitant la structure et la fonction de la MEC. Des progrès significatifs dans la conception des échafaudages ont été réalisés lorsque des organes relativement simples, tels que les vaisseaux sanguins, la peau, la vessie et le cartilage, ont été conçus43,44,45,46,47. Le myocarde, au contraire, est très difficile à concevoir en raison de son anisotropie 3D, de ses propriétés biomécaniques déroutantes et de sa bio-architecture micro/nano compliquée.

Jusqu'à présent, les échafaudages cardiaques ont été fabriqués en utilisant des matériaux biologiquement inertes pour être un simple support pour la croissance cellulaire. Au lieu de cela, l'ECM myocardique, qui est l'échafaudage naturel du myocarde, est un matériau d'échafaudage produit par les fibroblastes et constitué d'une substance gélatineuse (matrice) et de fibres de différentes longueurs et rigidités, et peut traiter le destin cellulaire. Les fibroblastes quiescents sont distribués dynamiquement dans le myocarde, tandis que les troubles pathologiques déclenchent leur activation en myofibroblastes, subvertissant la composition et l'accumulation de la MEC et donc la fonction myocardique48. L'ECM délivre des signaux biologiques (facteurs de croissance, cytokines, hormones, etc.) et physiques (tels que facteurs mécano-structuraux, rigidité, nano rugosité, micro-porosité, etc.) concourants pour moduler le devenir des cellules cardiaques. Outre les signaux biologiques, une attention particulière a été portée jusqu'à présent à déchiffrer comment les cellules traduisent les stimuli mécaniques en signaux intracellulaires, alors que seules quelques études se sont concentrées sur le mécanisme cellulaire de détection des signaux électriques (électrodétection).

Plusieurs études ont mis en évidence que les matériaux bio-instructifs, dotés à la fois d'indices bioélectriques et topographiques, représentent une approche prometteuse pour régénérer des tissus hautement anisotropes tels que le muscle squelettique. En 49, l'alignement des nanofibres et la concentration de PANI dans les échafaudages de polycaprolactone électrofilés se sont avérés induire la formation de myotubes dans les myoblastes, confirmant les effets synergiques des signaux électriques et topographiques. Cependant, les mécanismes en profondeur par lesquels les matériaux électroconducteurs instruisent les cellules restent à comprendre. D'autres études50,51,52,53,54 ont démontré l'efficacité des échafaudages électroconducteurs, mais aucune preuve concluante n'a jusqu'à présent été rapportée sur le rôle de leur conductivité électrique. En effet, des signaux électriques plus faibles que le potentiel d'action ont été détectés de manière extracellulaire en utilisant la technologie des réseaux multiélectrodes55,56,57,58,59 mais, très probablement, leur action seule n'est pas suffisante pour déterminer le destin cellulaire. Les effets bénéfiques des constructions électroconductrices ont également été observés lorsqu'ils sont implantés sur le site de la blessure dans des modèles MI de rat60,61,62,63. Néanmoins, ces études visaient principalement à répéter les caractéristiques du myocarde mature pour combler l'écart de conductivité créé par les cicatrices post-infarctus, où le rationnel était simplement de recréer un guidage pour l'impulsion électrique présidant à la contraction myocardique. Une idée innovante pourrait être de développer un système d'identification et de caractérisation de microcourants potentiellement non impliqués dans la contraction, mais pertinents (avec d'autres signaux physiques et biologiques) dans la communication cellule-cellule pour déterminer le destin cellulaire. Dans ce contexte, nous avons proposé une étude technique préliminaire pour développer des échafaudages électroconducteurs pour étudier l'électro-détection des cellules cardiaques immatures. L'optimisation du procédé de micro-stéréolithographie haute résolution nous a conduit à obtenir des systèmes PEGDA-PANI électroconducteurs imprimés en 3D. Différentes concentrations de PANI permettent de moduler l'électroactivité et l'électroconductivité de manière à ce que les signaux électriques et mécano-spatiaux puissent être réciproquement réglés pour délivrer des stimuli aux cellules immatures. Ces réalisations sont importantes en vue de déterminer le destin des cellules et de maintenir leur phénotype final. À cet égard, les tests de viabilité cellulaire réalisés démontrent que les matériaux PEGDA-PANI n'induisent pas d'effets cytotoxiques sévères et confirment leur validité en tant qu'échafaudages pour une compréhension plus approfondie des signaux biologiques et physiques régissant le développement des cellules.

La micro-stéréolithographie par projection s'est avérée être un outil utile pour imiter la bioarchitecture striée du tissu cardiaque. Les échafaudages, bien que semi-conducteurs, ont montré leur efficacité biologique lorsqu'ils sont cultivés avec des cellules progénitrices cardiaques de souris. Il montre que dans le cadre de référence des cellules souches cardiaques immatures, les échafaudages semi-conducteurs peuvent améliorer la communication intercellulaire et la synchronisation des cellules en développement/immatures.

En effet, le développement d'échafaudages aussi électriquement conducteurs que le myocarde (0,16 S/m) est hautement souhaitable pour fabriquer des tissus cardiaques modifiés et, éventuellement, pour restaurer les fonctions électriques perdues du cœur blessé. Cependant, il est toujours difficile de développer de telles constructions en utilisant la technologie actuelle. Par conséquent, on peut conclure que les échafaudages électriquement conducteurs pourraient fournir de meilleures plates-formes lorsqu'il s'agit de concevoir des tissus biologiques hautement conducteurs par rapport aux échafaudages non conducteurs. Cependant, de nouvelles alternatives aux polymères conducteurs qui seraient biodégradables et peuvent démontrer des propriétés électriques élevées doivent être trouvées pour faire passer les échafaudages conducteurs actuels de semi-conducteurs à bons/hauts conducteurs.

Les auteurs déclarent que les ensembles de données pertinents à l'appui de cette étude sont donnés dans cet article. Cependant, les ensembles de données brutes à l'appui de divers résultats peuvent être demandés à l'auteur correspondant.

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Département des sciences cliniques et de médecine translationnelle, Université de Rome "Tor Vergata", Via Montpellier 1, 00133, Rome, Italie

Arsalan Ul Haq, Francesca Pescosolido, Felicia Carotenuto & Paolo Di Nardo

Centre Interdépartemental de Recherche en Médecine Régénérative (CIMER), Université de Rome "Tor Vergata", Via Montpellier 1, 00133, Rome, Italie

Arsalan Ul Haq, Francesca Pescosolido, Felicia Carotenuto, Fabio De Matteis, Emanuela Tamburri & Paolo Di Nardo

Département des sciences et technologies chimiques, Université de Rome "Tor Vergata", Via Della Ricerca Scientifica, 00133, Rome, Italie

Luca Montaina, Francesca Pescosolido et Emanuela Tamburri

Département d'ingénierie d'entreprise "Mario Lucertini", Université de Rome "Tor Vergata", Via del Politecnico 1, 00133, Rome, Italie

Federica Trovalusci

Département de génie industriel, Université de Rome "Tor Vergata", Via del Politecnico 1, 00133, Rome, Italie

Fabio de Matteis

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Conceptualisation : AUH, LM, ET, FDM, FC, PDN ; Optimisation des paramètres d'impression : AUH ; Enquête : AUH, LM, FP, FC ; Conservation et interprétation des données : AUH, LM, FP ; Supervision et validation : ET, FDM, FC, PDN ; Préparation du projet écrit-original : AUH, LM, FP, ET ; Rédaction-révision et édition : ET, FDM, FC, FT, PDN Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit.

Correspondance à Paolo DiNardo.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Ul Haq, A., Montaina, L., Pescosolido, F. et al. Échafaudages électriquement conducteurs imitant la structure hiérarchique des myofibres cardiaques. Sci Rep 13, 2863 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29780-w

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Reçu : 06 octobre 2022

Accepté : 10 février 2023

Publié: 17 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-29780-w

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